自然杀伤（NK）细胞是机体重要的免疫细胞，能有效杀伤多种肿瘤靶细胞。激活NK受体的信号整合后可激活NK细胞，但这些受体会被潜在靶细胞上的特异性抑制受体分子MHC-1所抑制。因此，当MHC-1低表达时，NK细胞能有效杀伤肿瘤细胞。然而，在实体肿瘤中，肿瘤浸润的NK细胞常常表现出功能失调，激活受体表达水平降低而抑制受体水平升高，导致γ干扰素（IFN-γ）不足，不能正常发挥功能。这种功能障碍是否存在于所有的肿瘤浸润NK细胞，或是否存在分子异质性，至今尚未得到的解决。而如何预防和克服肿瘤组织中的NK细胞功能障碍，充分发挥NK细胞的抗肿瘤潜能，仍是一个具有挑战性的课题。

肿瘤微环境中存在的细胞和因子可以驱动免疫抑制，促进肿瘤的发展和转移。缺氧是实体肿瘤的常见特征。在低氧胁迫下，肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞通过分泌趋化因子来富集免疫抑制细胞（如骨髓来源的抑制细胞：2型巨噬细胞和调节性T细胞），从而抑制免疫细胞功能。细胞通过上调转录因子HIF-1α来适应缺氧，HIF-1α调控许多过程中的基因表达，如葡萄糖代谢、细胞增殖、生存和血管生成。在免疫系统中，已证明HIF-1α在许多不同的细胞类型中都有表达，并且能够促进血管生成及调节细胞的分化和功能。HIF-1α在实体瘤中非常常见，但尚不清楚HIF-1α在细胞水平上是如何调控NK细胞信号转导和抗肿瘤效应的。

本文通过敲除模型鼠中NK细胞中的Hif1a基因及使用HIF-1α抑制剂对人NK细胞进行长期培养，对肿瘤浸润NK细胞的单细胞RNA测序分析证明了在NK细胞中抑制HIF-1α可以增强其抗肿瘤活性。 

1. 缺乏hif1a的NK细胞表现出强大的抗肿瘤活性和有效抑制肿瘤生长

为了探究HIF-1α在长时间暴露于缺氧环境和实体肿瘤组织中NK细胞中的作用，构建NKp46⁺细胞中缺失Hif1a的模型鼠（Hif1a^f/fNcr1^iCreTg），其他免疫细胞具有相似Hif1a表达量的小鼠作为野生型（WT）对照，皮下注射10⁶个RMA-S淋巴瘤细胞，MHC I缺陷型导致WT小鼠肿瘤生长，模型鼠的肿瘤尺寸明显较小，而MHC I表达型肿瘤尺寸没有明显变化（图1A）。这表明HIF-1a在调节NK细胞抗肿瘤活性中具有重要作用。

图1. RMA-S细胞（MHC缺陷型，左）和RMA细胞（MHC表达型，右）的肿瘤尺寸

2. 肿瘤浸润NK细胞的高通量ScRNA-Seq揭示在Hif1a^f/fNcr1^iCreTg模型鼠中存在一个明显的NK效应亚群

对5721个NK单细胞（3075个WT，2646个Hif1a^-/-NK 细胞）进行scRNA-seq（图2A），聚类分析结果显示为6个不同类群（图2B），Hif1a^-/- 和 WT NK细胞簇间分布具有明显差异（图2C），1簇和4簇中90%以上的细胞为Hif1a^-/-NK细胞，而WT NK细胞大部分分布在2、3、5、6簇内（图2D）。在Hif1a^-/-NK细胞中细胞因子IFN-γ (Ifng)和激活标记物CD69 (Cd69)的转录本明显增多（4簇，图2E），在WT NK细胞中虽然4簇占细胞总数的比例＜10%，但在这些细胞中也表现出Hif1a低表达。在WT NK细胞中，Hif1a及其靶基因的低表达均与Ifng的转录本增加相关联。这充分说明HIF-1α对NK细胞活化和效应功能的调控起消极作用。

图2. A.  WT和Hif1a^f/fNcr1^iCreTg鼠注射RMA-S细胞两周后，进行单细胞RNA测序

B. 对5721个NK细胞进行聚类分析，得到6个不同亚群

C. Hif1a^-/- 和 WT NK细胞在总细胞中的分布

D. Hif1a^-/- 和 WT NK细胞所占百分比

E. Ifng和Cd69在4簇中高表达

对WT和Hif1a^-/-肿瘤浸润NK细胞间差异表达转录本的通路进行分析，发现在Hif1a^-/-NK细胞中NF-κB途径及涉及NF-κB活性通路的富集，同样存在于1簇和4簇中。重要的是，NF-κB激活的富集与Ifng基因的高表达相关，这与之前由Bezman等人报道的NK细胞激活信号一致。为证明这一点，使用流式细胞仪检测磷酸化p65 (p-p65)、p50和IκBɝ的表达（图2F），结果证实了p-p65和p50的增加，以及IκBz的诱导，因此HIF-1a的激活负调控肿瘤微环境中NK细胞中NF-κB的活性及其靶基因的表达，阻碍其效应功能的获得和维持。

图2.F. 流式细胞仪检测磷酸化p65 (p-p65)、p50和IκBɝ的表达量

3. Hif1a ^-/- NK细胞的抗肿瘤活性依赖于来自骨髓细胞的IL-18

为了探究肿瘤浸润NK细胞中增强NF-κB活性的驱动因素， 分析了来自整个肿瘤组织的细胞因子和趋化因子转录谱。与scRNA-seq数据一致，Ifng是缺失Hif1a的模型鼠和WT小鼠肿瘤组织中上调最高的转录本，与Ifng一样，编码细胞因子IL-18的mRNA在缺失Hif1a的模型鼠肿瘤组织中也检测到较高的丰度（图3A），之前也有研究报道过IL-18可以诱导NK细胞中IkBz的表达和IFN-γ的产生。接下来，通过使用注射mAb消除IL-18来研究IL-18在RMA-S肿瘤控制中的作用（图3B），结果表明，HIF-1a的缺失增强了NK细胞对IL-18的反应，而IL-18在Hif1a^f/fNcr1^iCreTg小鼠中是控制肿瘤生长所必需的。

图3.A.IL-18基因在肿瘤浸润NK细胞中的表达（上）及缺失Hif1a的模型鼠和WT小鼠中IL-18蛋白的含量（下）

B.肿瘤生长曲线图

4. 抑制小鼠NK细胞中的HIF-1α可导致效应功能增强和细胞代谢增加

为了进一步证实在Hif1a^-/-细胞中IL -18诱导效应功能的机制，模拟缺氧肿瘤微环境在体外培养Hif1a^-/- 和 WT NK细胞7天，用IL-12和IL-18刺激后，Hif1a-/-NK细胞比WT NK细胞产生了更多的IFN-γ（图4A）。药理抑制剂TPCA-1对NF-κB激活有抑制作用，在不影响细胞活力完全阻止IFN-γ的产生（图4B）。证实了其需要下游的IL-18R来生产IFN-γ，除了IFN-γ，TPC A-1还影响了细胞毒性效应物颗粒酶B和穿孔素的表达，表明NF-κB通路参与了IL-18介导的NK细胞多种效应物功能的调控。

图4.A IL-12和IL-18刺激后，Hif1a^-/-NK细胞比WT NK细胞产生了更多的IFN-γ

    B药理抑制剂TPCA-1完全阻止IFN-γ的产生

5. 在激活的人类NK细胞中抑制HIF-1α可导致效应反应增强

为了研究抑制HIF-1a是否以同样的方式增强人NK细胞的效应功能，用小分子化合物KC7F2（已报道具有抑制HIF-1a蛋白的稳定及其靶基因的转录功能）处理纯化的人外周血NK细胞。用KC7F2处理人NK细胞7天后，在IL-2存在的情况下，细胞脱粒以及IFN-γ和TNF-α(肿瘤坏死因子)的产生显著增强了，这些发现说明了HIF-1a抑制剂诱导人NK细胞提高功能的的潜力。为了研究HIF-1a是否会影响癌症患者NK细胞的抗肿瘤反应，分析了已发表数据集的单个NK细胞浸润非小细胞肺癌(NSCLC)和肿瘤周围组织的转录谱，我们观察到与肿瘤周围NK细胞相比，肿瘤浸润NK细胞高表达HIF1A与其靶基因表达升高和IFNG转录降低相关，NK- il18 - ifng信号降低，进一步支持了NK细胞在肿瘤中的消极调控，这与单个NK细胞中HIF1A的表达呈负相关。

 图5.KC7F2处理人NK细胞7天后，细胞脱粒以及IFN-γ和TNF-α的产生显著增强

6. 一个NK-IL18-IFNG^high信号预测着在不同癌症实体中总体存活率的提高

研究发现，在HIF-1a缺失的情况下，肿瘤微环境中IL-18的存在导致NK细胞反应增强，表现为NF-κB激活和Ifng表达，从而导致肿瘤生长减缓。因此，NK细胞中NK- il18 - ifng标记与HIF1A表达呈负相关。因此，我们的目的是分析在人类肿瘤样本中NK-IL18-IFNG的整体特征是否可能预测癌症患者的生存率提高。对自于469名皮肤黑色素瘤(SKCM)患者样本的分析显示，在SKCM肿瘤中IL18和IFNG基因表达呈正相关(图6)。NK-IL18-IFNG^high信号与患者总体生存率相关，在乳腺癌(乳腺癌浸润性癌[BRCA]，n = 1093)和宫颈癌(宫颈癌鳞状细胞癌[CESC]，n = 304)患者中也发现了类似的相关性。

 图6.SKCM肿瘤中IL18和IFNG基因表达呈正相关

NK细胞在实体肿瘤中表现为不活跃的功能失调状态，在肿瘤微环境中诱导NK细胞活性的新策略有助于改进现有的NK细胞治疗方法。研究表明，在肿瘤微环境中，转录因子HIF-1a具有免疫检查的作用从而抑制NK细胞。NK细胞中Hif1a的缺失和HIF-1a抑制剂的使用释放了高效应功能，这种高效应功能主要表现在肿瘤反应性小鼠和人NK细胞中IFN-γ的产生。因此，选择性抑制NK细胞中的HIF-1a可能是改善NK细胞治疗实体瘤的一种有前景的策略。