图文并茂| 专题三： 新一代CAR-T技术。
1 CAR-T细胞疗法是近几年来一种新兴的癌症治疗方法：患者的T细胞在实验室中通过基因工程改造后，能够识别、结合其癌细胞上的特定蛋白（抗原），并启动程序杀死这些癌细胞。整个流程主要分5步：（1）抽取患者的血液，从中提纯T细胞；（2）在实验室中将称为嵌合抗原受体（CAR）的基因引入到T细胞中——这种在细胞膜上表达人工设计的CAR蛋白的细胞，就成为了CAR-T细胞；（3）在实验室中培养、繁殖数百万个CAR-T细胞；（4）通过静脉注射将CAR-T细胞重新输入患者体内；（5）CAR-T细胞与癌细胞上的抗原结合后，拉响“警报”，进入战斗状态，最终将癌细胞杀死。
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2 相对于药物疗法，细胞疗法的优势是细胞可以完成更复杂的任务，而且疗效持久——注射一次，可以维持数月甚至数年。其缺点是生产过程复杂。而且如果是异体细胞移植，还需要克服来自宿主的免疫系统排斥。也正是因为这点，大部分细胞疗法，包括CAR-T，使用的是患者自己的扩增、改造或加工过的细胞。
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3 CAR-T细胞疗法是一个典型的“模仿自然，高于自然”的创新。CAR蛋白的设计建立在T细胞受体（TCR）的基础上，但在机理上又摆脱了MHC/HLA的限制，并引进了CD28、4-1BB等结构元素。CAR蛋白一般具有以下几个结构域：（1）细胞膜外的抗原识别片段：多为单链可变片段(scFv)，相当于一个小抗体；（2）scFv和跨膜域之间的联结区：其长短会影响CAR-T的活性；（3）跨膜域：联结CAR膜外结构与膜内信号传导结构；（4）共刺激域：从第二代CAR-T开始引进，有加强细胞因子表达、促进T细胞增殖的功能；(5) 信号传导域：可激活T细胞，引起对癌细胞的杀伤作用。
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4 和其它高科技产品一样，CAR-T技术也在被不断改进，不断换代。CAR蛋白是近年来技术改进的主攻方向。第一代CAR没有共刺激域，所以在结合肿瘤细胞抗原后，CAR-T繁殖不够，不能持久，并且不能分泌足够多的细胞因子。因此第一代CAR-T对肿瘤细胞的杀伤力不够，最终未能进入市场。第二代CAR装备了CD28或4-1BB共刺激域——目前市场上的两个产品都是第二代CAR-T。第三代CAR既有CD28又有4-1BB，具有更强、更持久的杀伤力。
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5 CAR-T对肿瘤细胞的杀伤力来源于CAR激活后启动的信号传导通路。在CAR-T表面的CAR与肿瘤细胞表面的特定抗原结合后，通过一系列信号传导，或分泌多种细胞因子，或释放颗粒酶、穿孔素等蛋白，从而引起肿瘤细胞的自杀。
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6 迄今为止，已有两个CAR-T产品进入市场: KymriahTM和Yescarta®。二者都是第二代CAR-T，一个重要的区别是它们的CAR蛋白的共刺激域不同。两个产品在临床上的不同表现也许是源于这一差异：Yescarta®在病人体内增殖快，但持久性差，有可能引起早期细胞因子风暴（CRS）；而KymriahTM在病人体内增殖慢，但持久性好，有可能引起延迟的CRS。
7 KymriahTM和Yescarta®都是针对CD19和B细胞淋巴瘤，先后于2017年首次获批上市。它们疗效显著，但也存在着很大的改进空间。
8 KymriahTM和Yescarta®两个细胞产品生产过程复杂，需要对每个患者单独制备，很难产业化，导致价格居高不下，因此限制了它们的销售。另外这一代CAR-T适用范围窄，很难应用到实体瘤上。而且其副作用大，在一些患者中引起CRS， 甚至导致死亡。众多生物技术和制药公司正研发新一代CAR-T技术，从商业性和产品性能两大方面进行改进，希望能克服这些局限性。
9 若想进一步改进产品性能，CAR-T技术必须解决五大挑战：（1）渗入：如何让T细胞有效地进入实体瘤的内部；（2）识别：如何让T细胞高精度地识别肿瘤细胞，而不滥伤无辜；（3）持久：如何保证T细胞扩增到足够多的数量、存活至足够长的时间，从而铲除所有的肿瘤细胞；（4）破境：如何使T细胞克服肿瘤周围的免疫抑制性的微环境（TME）；（5）控制：如何能有效地控制、调节T细胞的启动、关闭、活性、持续时间和作用地点。
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10 改进CAR-T的产品性能也正是从这五个维度下手。对实体瘤来说，“渗入”和“破境”是前提。而对所有肿瘤而言，提高疗效的重点是改进“识别”和“持久”，提高安全性的重点则是完善“识别”和“控制”。
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11 第二代CAR-T和第一代相比，主要在“持久”方面得到了很大的改进。现在各个公司在开发新一代CAR-T时，各显神通，专攻一个或多个维度。我们可以预见，未来的CAR-T产品，除了需要在这五个维度上做到完美，还要提高其商业性——降低成本、合理定价、开发通用型（off-the-shelf）CAR-T。通用型CAR-T细胞是指消除或降低了引起免疫排斥的风险的异体细胞，可批量生产，而不必针对每个患者单独制备。
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12 CAR-T不同于小分子药或蛋白药。它是“活”的药，而且可以添加很多功能。改进CAR-T的一个方向是借鉴系统生物学/合成生物学的理论，引入传感器、逻辑门、逻辑电路等概念，把它打造成一个机器人或智能系统。CAR-T is an engineered cell. Then why don’t we engineer the heck out of it?
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13 沿着这一思路，加州大学（旧金山）的Wendell Lim教授发明了SynNotch技术。SynNotch是一种合成的Notch受体，通过基因工程在T细胞表面永久性地表达。我们可以把它看作一种新型的CAR，其膜外结构也是抗体片段，识别并结合抗原A。A的结合引起SynNotch的膜内肽链被裂解，释放出连接的转录因子。转录因子进入细胞核，特异性地启动第二个CAR的转录。第二个CAR表达后，插入细胞膜，如果遇到第二个抗原B，会进一步激活下游信号，进入杀伤模式。SynNotch技术相当于给T细胞装了一个“与门”， 只有在接触到的细胞表达两种抗原A和B的情况下，才会被激活。
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14 SynNotch技术在小鼠实验中已被验证。小鼠左侧接种单抗原肿瘤，右侧接种双抗原肿瘤。静脉注射的人源SynNotch CAR T 细胞（CD4+细胞和CD8+细胞1：1的混合）只对双抗原的肿瘤有疗效。
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15 SynNotch CAR-T疗法的优势是能够更精准地歼灭（表达两种抗原的）肿瘤细胞，而不伤害患者体内健康的（只表达一种抗原的）细胞或组织。其缺点是从CAR1被激活到CAR2被激活有一个时间差，因此无法做到双靶点同步激活。
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16 很少有实体瘤只依靠一个表面抗原就能被区分。因此，识别多靶点的SynNotch CAR-T技术除了可以减少副作用外，还可以扩展CAR-T的靶向空间。
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17 除了SynNotch CAR-T技术，Lim的团队还发明了ThrottleTM技术——用小分子药开关CAR-T。以这两个技术为基础，Lim于2015年创立了Cell Design Labs公司。Cell Design Labs与另一家CAR-T公司Kite有合作关系。2017年，在Gilead并购了Kite之后，Kite/Gilead几个月后又收购了Cell Design Labs。首付1.75亿美元，再加上各种里程碑，收购价最高可达5.67亿美元。
18 一个故事的结束往往意味着另一个故事的开始。 Wilson Wong博士曾在Wendell Lim的实验室做了将近5年的博士后。2012年初，Wong离开了北加州，来到波士顿大学任职。他也按着合成生物学的思路创造了一个新的CAR-T技术——SUPRA CAR，并于2018年2月联合创立一家生物技术公司Senti Biosciences来开发这一技术。
19 Senti Bio的其他几名联合创始人也是赫赫有名，包括MIT的Tim Lu和Jim Collins。公司的技术平台除了SUPRA CAR外，还包括小分子CAR-T开关和加强型免疫细胞（Advanced Arming）。
20 Senti Bio在CAR-T中引进了更多的逻辑门。除了多靶点识别的“与门”（A AND B)外，还有“或门”(A OR B)和SAND (“A NOT B”)。每种逻辑门的功效不同，可以根据实际需要灵活选择。
21 SUPRA CAR技术可以帮助实现这些逻辑门。SUPRA CAR系统中，CAR蛋白被分拆，成为两个蛋白：zipCAR和zipFv。zipCAR是跨膜蛋白，其细胞外结构是一个亮氨酸拉链，而zipFv是一个融合scFv，装有同源亮氨酸拉链，可以与zipCAR上的亮氨酸拉链互补结合。这个系统将CAR-T模块化，带来了更大的灵活性。其治疗模式是细胞治疗加蛋白治疗。对不同的肿瘤，只需一种zip-CAR-T细胞，但需要更换不同的传感器——zipFv。SUPRA CAR系统可以通过改变以下几个变量来调整其特性：（1）亮氨酸拉链对之间的亲和力，（2）肿瘤抗原和scFv之间的亲和力，（3）zipFv的浓度，和（4）zipCAR的表达水平。
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22 SUPRA CAR技术在小鼠肿瘤模型中已经得到验证。单独输入RR zipCAR T细胞并不能减少肿瘤负荷。只有同时引进EE zipFv蛋白后，RR zipCAR T + EE zipFv（RRzip与EEzip互补）才能有效抑制肿瘤，其活性接近于一个传统的CAR-T（a-Her2 CAR）。
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23 SUPRA CAR系统实现的“或门”展示。将表达双抗原的K562肿瘤细胞与表达RR-zipCAR的CD8 + T细胞共同培养，加入两种识别单抗原的zipFv中的任何一种都能够对肿瘤细胞起到杀伤作用。
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24 SUPRA CAR系统实现的可调性“与门”展示。RR zipCAR和FOS zipCAR分别装备了CD28 / 4-1BB共刺激域和CD3z信号域，信号传导相对独立。a-Her2 zipFv与FOS zipCAR结合，进一步被抗原Her2激活后，指令下传给CD3z结构域，继而增加CD69的表达；而a-Axl zipFv与RR zipCAR结合，进一步被抗原Axl激活后，指令下传给CD28 / 4-1BB共刺激结构域，继而增加了IFN-g等细胞因子的释放。改变每个zipFv的浓度可以调节来自每个受体的信号输出强度，而且这两个通路有很强的协同作用。
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25 SUPRA CAR系统实现的“A AND NOT B”逻辑门展示。一种免疫细胞转基因后，其表面会表达两种zipCAR，其中一种的膜内域被激活后会抑制另一种的信号通路。在这个例子中，a-Her2 zipFv通路激活了免疫细胞，但加入a-Axl zipFv会抑制免疫细胞的激活，从而减弱了对肿瘤细胞的杀伤作用。
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26 SUPRA CAR的优势是其灵活性、可调性、多功能性、可编程性和应用广泛性。它主要存在两个缺点：（1）这种治疗方法是细胞疗法和蛋白药疗法的组合，给生产、申报、给药增加了复杂性。（2）由于zipFv是一种游离的scFv，体内半衰期短。若想维持CAR-T的疗效，需要不断补充scFv。Senti Bio将如何扬长避短，挖掘出这一技术的最大潜力？我们将继续关注。
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27 Senti Bio只是研发新一代CAR-T技术的公司之一。目前仅在美国就有几十个相似的或相竞争的生物技术公司。每个公司的技术各有千秋，但最终目标都是改进CAR-T的产品性能或商业性能。
28 医药界渴望的是开发出针对实体瘤的通用型CAR-T。只有实现了这一目标，CAR-T才能“跨越鸿沟"，从小众产品转变为大众产品，以更好地造福人类。（完）
参考资料：
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8. “Deciphering CAR T cells: Exploring functional mechanisms to drive next generation immunotherapy “ Riddell, S. and Lim, W. Science Webinar 04/11/2019
9. Dr. Gary Lee's talk at “Science Alliance: Advancements in Immuno-Oncology” JLABS Symposium 04/04/2019