Immunity：胞内结构域改造可使CAR-T更持久
作为一种新型疗法，CAR-T细胞治疗在多种非实体瘤中都收获了不错的效果，但仍存在一些缺陷和不足。例如，在B细胞恶性肿瘤中，约有10%-20%的患者未能取得完全缓解（CR），在取得完全缓解的患者当中，又有约30%-50%的患者在不到1年的时间内复发。在实体瘤中，CAR-T疗法的情况更加不容乐观，大部分实体瘤患者对CAR-T疗法的响应率实际上是很低的。
为了能够使输入体内的细胞尽可能多的发挥疗效，如何使CAR-T细胞变得更持久（persistence）是目前该领域研究的重点之一。来自上海科技大学的HaopengWang、中国科学院大学的Chenqi Xu以及复旦大学附属眼耳鼻喉科医院的Haitao Wu等人对此进行了研究，科研成果于2020年8月5日发表在Cell旗下期刊Immunity上，论文题目为《Chimeric Antigen ReceptorDesigned to Prevent Ubiquitination and Downregulation Showed Durable AntitumorEfficacy》。
在对T细胞受体（TCR）的研究中，科学家早已观察到这样的现象：在抗原与TCR结合后，TCR会发生泛素化并导致其蛋白水平下调，而抑制TCR的泛素化过程则会大大增强T细胞的活性，那么CAR在受到抗原刺激之后是否也会经历泛素化并导致CAR-T的活性受到影响？这篇论文从CAR的泛素化修饰入手，找到了激活CAR-T活性的办法。
论文的Graphical Abstract如下图所示。当CAR-T细胞表面的CAR受到抗原刺激后，其胞内结构域会发生泛素化修饰，泛素化修饰后的CAR被内化（internalization）之后会通过溶酶体途径降解，这将大大降低CAR-T细胞的活性，而无泛素化修饰的CAR被内化之后仍然会回到细胞表面。研究人员发现，将CAR胞内结构域的泛素化位点（赖氨酸残疾）突变掉之后可以成功阻断CAR被泛素化、内化进而导致溶酶体降解的这个过程，从而提高CAR-T对肿瘤细胞的杀伤效果。
论文当中代表性的Figure如下：
（1） 抗原激活CAR-T细胞导致CAR表达下调
将表达19z CAR的CAR-T细胞与过表达CD19的K562细胞共同培养过夜，使用流式细胞仪检测CAR-T细胞表面19z CAR的蛋白水平，并使用Western Blot检测CAR-T细胞中19z CAR蛋白的整体表达水平，可以看到在CD19刺激之后，不仅CAR-T细胞表面的CAR蛋白水平下降，细胞整体水平上CAR的蛋白水平也发生了下调：
（2）激活的CAR被多泛素化修饰并降解
在CD19-K562刺激之后，CAR-T细胞中的19z CAR泛素化水平在10min内便升到了相当高的水平，且其蛋白量逐渐降低；蛋白泛素化主要发生在lysine残基上，将 19z CAR胞内的lysine全部突变为arginine之后（即19BB zKR），CAR的稳定性显著增加。
（3）19BBz CARKR-T细胞杀伤肿瘤的活性远高于19BBz CARWT-T细胞
不管是细胞实验（A）还是小鼠模型（B）中，都观察到19BBz CARKR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性要远高于未经改造的19BBz CARWT-T细胞：
在输注35天内对小鼠体内肿瘤细胞的荧光信号进行定量，可以明显看到改造后的19BBz CARKR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果更为持久：
（4）19BBz CARKR-T细胞下游信号通路的激活程度要高于19BBz CARWT-T细胞
前人研究表明，常用的CAR共刺激信号4-1BB可以在CAR受到抗原刺激后招募下游脚手架蛋白TRAF2，TRAF2再与其它蛋白结合向下游传递激活信号。本研究所使用的CAR包含一个4-1BB共刺激结构域（如下图所示）。数据显示，在接受抗原刺激后，4-1BB与TRAF2蛋白的结合增强，且lysine突变的19BBz CARKR 与TRAF2的结合要强于未经改造的19BBz CARWT，说明改造之后的19BBz CARKR 可以向下游传递更强的激活信号。
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