经过冷冻保存及扩增的 NK 细胞还有功效吗？
近年来，通过免疫细胞疗法治疗癌症已成为一种新兴的治疗方式。
在免疫细胞治疗领域，研究人员颇为专注的 T 细胞抗肿瘤方法取得了显著进展，目前全球已有 11 款 CAR - T 细胞疗法获批上市用于治疗血液系统的恶性肿瘤（美国 6 款，我国 5 款），首款应用于治疗实体瘤的 TIL 疗法也已获批上市。
而 NK 细胞作为免疫细胞的一种，同样备受关注，在国际上有着众多的研究成果。由于 NK 细胞在一线免疫应答中起着关键作用且反应迅速，因此越来越多的研究聚焦于以 NK 细胞为基础的癌症免疫治疗。以 NK 细胞为基础的癌症治疗的主要方法包括细胞因子、抗体，以及通过改善 NK 细胞的持续性、活化、数量或肿瘤细胞靶向性而过继转移体外 NK 细胞。
NK 细胞源自英文 Natural Killer cell，即自然杀伤细胞，其特点是无需激活即可直接投入战斗。NK 细胞是人体先天性免疫细胞的核心细胞，被视作人体健康的 “第一道防线”。
与同属先天性免疫细胞家族的中性粒细胞、巨噬细胞等相比，其清除细菌、抵御病毒的范围更为广泛。
与获得性免疫细胞 T 细胞相比，在遭遇 “敌人” 入侵时反应更为灵敏，且 “杀敌” 范围更广，不仅限于杀伤肿瘤细胞，在抵御病毒、抗衰老方面也有所建树。
此外，由于 NK 细胞具有 “免疫记忆”，可实现与获得性免疫相同的功能，其在肿瘤疫苗等领域也备受期待。
NK 细胞具有广谱的抗肿瘤作用，对几乎所有常见的癌细胞类型都有杀伤作用，包括肺癌、乳腺癌、肝癌、淋巴癌、食道癌等。NK 细胞的抗癌机制多样。众多研究中 NK 细胞已被广泛应用于各种癌症治疗，并取得了不错的治疗效果。
另外，有研究显示，与健康人相比，癌症患者体内的 NK 细胞活性通常明显降低，因此，有效增加 NK 细胞数量，提高细胞活性被认为是提升癌症患者免疫力的重要因素。
那么在体外扩增和冷冻过后的 NK 细胞是否还具备完整的杀伤能力和高活性呢？一篇发表在《BLOOD》上的研究内容表明，符合 GMP 标准生产的外周血来源 NK 细胞，在经过体外扩增后仍具有高度的活性与杀伤能力，并且在低温冷冻前和解冻后同样具有高度的活性与杀伤能力。
一项 “-80℃短期冻存对 NK 细胞功能及杀伤活性的实验研究” 报道，探讨了 - 80℃短期冻存不同时间对 NK 细胞及杀伤活性的影响。
研究人员采集和分离健康人外周血单个核细胞，在体外培养扩增细胞，扩增 12 天后将部分 NK 细胞于 - 80℃冻存 1/4/12/24 周。
通过流式细胞仪分析冻存不同时间的 NK 细胞的表型、凋亡百分率、颗粒酶 B、穿孔素及 CD107a 表达。如图所示，-80℃冻存 24 周的 NK 细胞与未冻存的 NK 细胞的表型、活性、颗粒酶 B、穿孔素及 CDl07a 表达相比，差异有统计学意义 (P < 0.05)。而 - 80℃冻存 12 周内的 NK 细胞与未冻存的 NK 细胞各组相比，差异无统计学意义 (P > 0.05)。
研究人员进一步研究冻存不同时间的 NK 细胞对食管癌细胞株杀伤活性的影响。取冻存前后的 NK 细胞作为效应细胞，复苏的食管癌细胞为靶细胞，在效靶比为 10：1 时未冻存的 NK 细胞与冻存 1、4、12、24 周的 NK 细胞的杀伤活性分别为 63.78％、62.03％、61.87％、60.94％、52.67％。冻存 24 周的 NK 细胞与未冻存 NK 细胞的杀伤活性比较，差异有统计学意义 (P < 0.05)。
研究表明，-80℃冻存 12 周以内的 NK 细胞与未冻存的 NK 细胞比较，在表型和凋亡百分率方面均无明显变化，且细胞功能及杀伤活性也无明显改变。
脐带血中 NK 细胞含量丰富，所占比例是外周血的 3 倍，也是 NK 细胞很有前途和无创的来源。脐带血往往需要长期冷冻，那么其用于 NK 细胞体外扩增是否还具有活性呢。一项发表在《J Immunother》杂志上的研究表明，长期深低温保存的 NK 细胞并不影响其扩增能力和抗肿瘤活性。
研究人员从脐带血中分离并体外扩增了大量激活的 NK 细胞，根据冻存时间长短，将脐带血分为三个组别：长期组（深低温冻存 1 - 10 年）、短期组（深低温冻存小于 1 年）、未冻存组（未经冻存的脐带血），然后观察这些 NK 细胞杀伤乳腺癌细胞的作用及其扩增潜力和抗肿瘤效应功能。
研究发现，培养 28 天后，未冻存组、短期组、长期组的脐带血来源 NK 细胞都产生了类似的、稳定的指数级别扩增量，没有显著差异。同时离体扩增的脐带血来源 NK 细胞具有增加的激活标志物的表面表达，并通过产生稳定水平的促炎细胞因子，干扰素 γ 和肿瘤坏死因子 - α 显示出有效的抗肿瘤功能。
此外，扩增的 CB - NK 细胞显示出对来自三阴性乳腺癌和雌激素受体阳性 / 孕激素受体阳性乳腺癌患者的原发性乳腺癌细胞的细胞毒性。
研究表明，长期冷冻保存对扩增的脐带血来源 NK 细胞的扩增潜力或效应功能没有影响，长期冷冻保存的 CB 在临床上仍然可用于治疗性 NK 细胞的离体扩增。
免疫细胞治疗作为一种新兴的癌症治疗模式，与传统的癌症治疗方法相比，因具有安全性、针对性、持久性、全身性、彻底性以及适应症广等特点备受关注。
免疫细胞治疗经过长足的发展，已经在多种癌症的治疗上发挥了很好的疗效，给人们带来了曙光。未来生物科技的发展一定能进一步提高其疗效与特异性，扩大适应症范围，为更多处在病痛中的人们带来希望。
在免疫细胞治疗领域，研究人员颇为专注的 T 细胞抗肿瘤方法取得了显著进展，目前全球已有 11 款 CAR - T 细胞疗法获批上市用于治疗血液系统的恶性肿瘤（美国 6 款，我国 5 款），首款应用于治疗实体瘤的 TIL 疗法也已获批上市。
而 NK 细胞作为免疫细胞的一种，同样备受关注，在国际上有着众多的研究成果。由于 NK 细胞在一线免疫应答中起着关键作用且反应迅速，因此越来越多的研究聚焦于以 NK 细胞为基础的癌症免疫治疗。以 NK 细胞为基础的癌症治疗的主要方法包括细胞因子、抗体，以及通过改善 NK 细胞的持续性、活化、数量或肿瘤细胞靶向性而过继转移体外 NK 细胞。
一、什么是 NK 细胞？
NK 细胞源自英文 Natural Killer cell，即自然杀伤细胞，其特点是无需激活即可直接投入战斗。NK 细胞是人体先天性免疫细胞的核心细胞，被视作人体健康的 “第一道防线”。
与同属先天性免疫细胞家族的中性粒细胞、巨噬细胞等相比，其清除细菌、抵御病毒的范围更为广泛。
与获得性免疫细胞 T 细胞相比，在遭遇 “敌人” 入侵时反应更为灵敏，且 “杀敌” 范围更广，不仅限于杀伤肿瘤细胞，在抵御病毒、抗衰老方面也有所建树。
此外，由于 NK 细胞具有 “免疫记忆”，可实现与获得性免疫相同的功能，其在肿瘤疫苗等领域也备受期待。
二、NK 细胞的作用机制
- 贯穿穿孔素 - 颗粒剂系统，这些穿孔素的释放是细胞溶解最快、最有效的机制。
- 细胞凋亡的诱导由 TNF 配体家族完成。此机制速度较慢且效率较低，需要细胞表面存在 TNF 配体，这些配体将与靶细胞表面的 Fas 受体结合。
- 活化的 NK 细胞通过 IFN - γ 的活性，分泌多种细胞因子（IFN - γ、TNF - α、IL - 10、IL - 13 等）。
三、NK 细胞与癌症
- 预防癌症：精准排查癌细胞
- 抗击癌症：有效的广谱抗癌细胞
NK 细胞具有广谱的抗肿瘤作用，对几乎所有常见的癌细胞类型都有杀伤作用，包括肺癌、乳腺癌、肝癌、淋巴癌、食道癌等。NK 细胞的抗癌机制多样。众多研究中 NK 细胞已被广泛应用于各种癌症治疗，并取得了不错的治疗效果。
另外，有研究显示，与健康人相比，癌症患者体内的 NK 细胞活性通常明显降低，因此，有效增加 NK 细胞数量，提高细胞活性被认为是提升癌症患者免疫力的重要因素。
四、扩增后的 NK 细胞还有作用吗？
那么在体外扩增和冷冻过后的 NK 细胞是否还具备完整的杀伤能力和高活性呢？一篇发表在《BLOOD》上的研究内容表明，符合 GMP 标准生产的外周血来源 NK 细胞，在经过体外扩增后仍具有高度的活性与杀伤能力，并且在低温冷冻前和解冻后同样具有高度的活性与杀伤能力。
一项 “-80℃短期冻存对 NK 细胞功能及杀伤活性的实验研究” 报道，探讨了 - 80℃短期冻存不同时间对 NK 细胞及杀伤活性的影响。
研究人员采集和分离健康人外周血单个核细胞，在体外培养扩增细胞，扩增 12 天后将部分 NK 细胞于 - 80℃冻存 1/4/12/24 周。
通过流式细胞仪分析冻存不同时间的 NK 细胞的表型、凋亡百分率、颗粒酶 B、穿孔素及 CD107a 表达。如图所示，-80℃冻存 24 周的 NK 细胞与未冻存的 NK 细胞的表型、活性、颗粒酶 B、穿孔素及 CDl07a 表达相比，差异有统计学意义 (P < 0.05)。而 - 80℃冻存 12 周内的 NK 细胞与未冻存的 NK 细胞各组相比，差异无统计学意义 (P > 0.05)。
研究人员进一步研究冻存不同时间的 NK 细胞对食管癌细胞株杀伤活性的影响。取冻存前后的 NK 细胞作为效应细胞，复苏的食管癌细胞为靶细胞，在效靶比为 10：1 时未冻存的 NK 细胞与冻存 1、4、12、24 周的 NK 细胞的杀伤活性分别为 63.78％、62.03％、61.87％、60.94％、52.67％。冻存 24 周的 NK 细胞与未冻存 NK 细胞的杀伤活性比较，差异有统计学意义 (P < 0.05)。
研究表明，-80℃冻存 12 周以内的 NK 细胞与未冻存的 NK 细胞比较，在表型和凋亡百分率方面均无明显变化，且细胞功能及杀伤活性也无明显改变。
脐带血中 NK 细胞含量丰富，所占比例是外周血的 3 倍，也是 NK 细胞很有前途和无创的来源。脐带血往往需要长期冷冻，那么其用于 NK 细胞体外扩增是否还具有活性呢。一项发表在《J Immunother》杂志上的研究表明，长期深低温保存的 NK 细胞并不影响其扩增能力和抗肿瘤活性。
研究人员从脐带血中分离并体外扩增了大量激活的 NK 细胞，根据冻存时间长短，将脐带血分为三个组别：长期组（深低温冻存 1 - 10 年）、短期组（深低温冻存小于 1 年）、未冻存组（未经冻存的脐带血），然后观察这些 NK 细胞杀伤乳腺癌细胞的作用及其扩增潜力和抗肿瘤效应功能。
研究发现，培养 28 天后，未冻存组、短期组、长期组的脐带血来源 NK 细胞都产生了类似的、稳定的指数级别扩增量，没有显著差异。同时离体扩增的脐带血来源 NK 细胞具有增加的激活标志物的表面表达，并通过产生稳定水平的促炎细胞因子，干扰素 γ 和肿瘤坏死因子 - α 显示出有效的抗肿瘤功能。
此外，扩增的 CB - NK 细胞显示出对来自三阴性乳腺癌和雌激素受体阳性 / 孕激素受体阳性乳腺癌患者的原发性乳腺癌细胞的细胞毒性。
研究表明，长期冷冻保存对扩增的脐带血来源 NK 细胞的扩增潜力或效应功能没有影响，长期冷冻保存的 CB 在临床上仍然可用于治疗性 NK 细胞的离体扩增。
免疫细胞治疗作为一种新兴的癌症治疗模式，与传统的癌症治疗方法相比，因具有安全性、针对性、持久性、全身性、彻底性以及适应症广等特点备受关注。
免疫细胞治疗经过长足的发展，已经在多种癌症的治疗上发挥了很好的疗效，给人们带来了曙光。未来生物科技的发展一定能进一步提高其疗效与特异性，扩大适应症范围，为更多处在病痛中的人们带来希望。