SPIKEY^™系统由两部分组成：1）SPIKEY™特有假病毒。包膜上嵌和有S蛋白的两种重组慢病毒假病毒，一种携带GFP和puromycin抗性基因，用于细胞水平评估；另外一种携带luciferase和puromycin抗性基因，既可用于细胞水平，也可用于动物模型评估。2）YJ1B09细胞株。过表达hACE2基因的293T单克隆细胞株，用于慢病毒假病毒感染筛选，通过计数GFP阳性抗性克隆数或读取luciferase荧光强度来评价感染效率，进而初步确定药物有效性。

 

我公司特别提供单克隆细胞株，经过研发人员精心筛选和评估，挑取了SPIKEY™假病毒感染效果最佳的一株单克隆，以确保达到更理想的效果。本文重点阐述过表达hACE2基因的293T单克隆细胞株的筛选。

 

Part I，慢病毒载体制备：

hACE2全长编码区亚克隆到慢病毒基因转移载体pLVX-IRES-BSD，层析纯化载体质粒pLVX-ACE2-IRES-BSD（结构如图1所示）、包膜蛋白质粒pVSV-G和包装质粒psPAX2，转染293T，包装慢病毒载体。 

 图1 质粒pLVX-ACE2-IRES-BSD的结构图

 

Part II，基于LentiQ工艺的慢病毒载体纯化：

hACE2慢病毒载体的纯化，同样的是基于中吉当康自主研发的LentiQ工艺流程（可点此参阅此前文章了解）。纯度极高同时可较长时间保存的病毒载体。

 

Part III，获得稳定表达hACE2的单克隆293T稳定细胞株：

利用VSV-G伪型包装的慢病毒LVX-ACE2-IRES-BSD感染293T细胞，加入抗生素blasticidin筛选并单克隆化，已经获得过量表达hACE2的293T混合克隆和单克隆细胞株。通过Western Blot验证hACE2的表达，结果如图2所示混合克隆和单克隆细胞株中hACE2均有稳定表达。

图2 混合克隆和单克隆细胞株中hACE2的表达

Part IV，”YJ1B09”定制版单克隆细胞株的筛选：

通常情况下，经过上一个步骤得到了稳定高表达hACE2基因的混合克隆和单克隆细胞株，均可达到交付状态。我公司进一步利用携带GFP的新冠假病毒（LVX-GFP-IRES-Puro）感染过量表达hACE2的293T混合克隆和单克隆细胞株，puromycin筛选计数GFP阳性集落数，获得比混合细胞克隆感染灵敏度提高数倍的单克隆细胞株。结果如图3所示，YJ1B09号克隆相比混合克隆和其它单克隆细胞株更容易被SPIKEY^TM假病毒感染。此细胞株 “YJ1B09”成为SPIKEY^TM假病毒试剂盒中的固定搭配。

图3 假病毒感染不同细胞株的克隆形成实验

 

SPIKEY™系统中的特定假病毒和YJ1B09细胞株，相得益彰，同时使用可将SPIKEY™系统的功能更加充分的发挥，使用户得到更可靠更丰富更理想的数据。共同提高新冠病毒的研究效率，这也是中吉当康倾力研发SPIKEY™系统的初衷。