免疫细胞专题 | 探索 NK 细胞的奥秘
NK 细胞概述
自然杀伤（nature killer，NK）细胞归属于天然淋巴样细胞家族。在人类中，通常将其定义为 CD3 - CD56 + 细胞，占循环淋巴细胞的 5% 至 15%。NK 细胞是抵御病毒感染和细胞突变的第一道防线，无需预先致敏便可杀死威胁宿主的癌细胞、异体细胞以及外来病原体感染的细胞，被视作癌症免疫监测、移植排斥和早期病毒免疫的关键效应细胞。
NK 细胞免疫疗法
CAR 免疫疗法的成功激发了研究者们利用其他免疫细胞进行癌症治疗的兴趣。简而言之，细胞免疫疗法就是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养使其数量倍增，然后再回输到人体。一方面，用于消除癌细胞、突变细胞；另一方面，激活并增强机体免疫力，控制癌细胞的转移和复发。与 CAR - T 疗法相比，NK 疗法能够靶向多种致病性抗原，具有更强的细胞毒性，且不分泌引发细胞因子释放综合征（CRS）的主要细胞因子，能够极大地减轻不良反应的风险，因而被寄予厚望。
NK 细胞治疗的主要策略
包括体外活化的自体或异体 NK 细胞、NK 细胞与单抗药（如免疫检查点抑制剂）联合以诱导抗体特异的细胞毒性（例如抗 EGFR 的西妥昔单抗）、CAR - NK 细胞免疫疗法等等。
目前尚无 NK 细胞疗法上市，但其临床试验正如火如荼地进行。截至 11 月份，在 clinicaltrials 网站上，关于 “NK Cell” 的搜索结果已高达 720 例。目前，NK 细胞疗法在急性髓细胞白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、神经母细胞瘤以及胃癌、肝癌、肺癌、肠癌等实体瘤的治疗中表现出良好的治疗效果。
体外扩增的 NK 细胞来源
NK 细胞除了可以从自体或异体的外周血中分离获得，还能够来源于脐带血、干细胞分化等。此外，由于以上三种方式获取细胞较为繁琐，在 CAR - NK 的研究中，不少研究者使用 NK - 92 进行进一步的修饰，临床前研究已经取得了较好的结果。值得注意的是，在输注前需要对细胞进行辐射。
准备：15mL 离心管（abs7102）或锥形管、Hank's 液（abs9257）或 PBS（abs962）、人淋巴细胞分离液（abs930）。
获取 PBMC：
- 准备无菌的 15mL 离心管或锥形管。
- 加入 5mL 淋巴细胞分离液（注意：淋巴细胞分离液使用前需恢复室温，18 - 25℃）。
- 用 Hank's 液（abs9257）或 PBS（abs962）缓冲液以 1:1 比例（如果全血样本粘稠，可适当增大比例）稀释抗凝过的全血样品。
- 小心沿着壁管，接近分离液层面，非常缓慢地将新鲜稀释过的 4mL 全血样品加在淋巴细胞分离液上面（注意：切记不要搅浑淋巴细胞分离液）。
- 小心放进离心机（水平转子），4℃离心 20 - 30min，速度为 400g - 1000g（注意：离心机刹车应取消，需等待自然停止）。
- 小心取出离心管，切记不要震动。
- 可见上层为淡红色透明血浆，其次为薄薄的致密白色环，即为 PBMC。
- 吸弃上清后，将白膜层轻轻地吸出来转移到新的离心管中。
- 用 PBS 重悬，室温下以 300g 离心 10min，重复操作 2 次，弃去上清，用少量 PBS 重悬。
NK 细胞的纯化
NK 细胞纯化最常用的方式是磁珠分选，包括阳性分选和阴性分选两种。人 NK 细胞发育阶段主要基于 CD34、CD117、CD56 和 CD94 的表达水平。CD56 表达增加是 NK 成熟的关键，CD56 + 和 CD16 + 可以鉴别和分离不受其他淋巴细胞污染的 NK 细胞。此外，白细胞介素 2/15 受体 β（CD122）也是 NK 细胞发育后期的重要标志。
NK 细胞培养
- 将纯化后的 NK 细胞用免疫细胞无血清培养基（abs9772）重悬，按照一定密度接种于培养皿或培养瓶中。
- 在免疫细胞无血清培养基中添加 100 - 200IU/mL 的 IL - 2，确保 NK 细胞的增殖和活化并有助于提高细胞毒性。与 IL - 15 联合应用可促进 NK 细胞的增殖，有利于 NK 细胞的激活。
- 将细胞置于 37℃的培养箱培养至少 48h，再进行后续细胞功能鉴定等实验。