激活人体免疫 “第一反应者”——NK 细胞的策略探索
自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK 细胞）在肿瘤和病毒感染免疫中扮演着 “第一反应者” 的关键角色，能够自发识别体内的异常细胞，并通过细胞毒性作用迅速将其清除，同时产生各类促炎细胞因子和趋化因子，进而招募和激活其他免疫细胞，启动适应性免疫反应。
如今，NK 细胞已成为抗肿瘤免疫治疗的重要靶点。接下来，让我们一同了解如何激活人体免疫的 “第一反应者”——NK 细胞。
一、NK 细胞激活机制
NK 细胞的活性是由一系列激活和抑制受体转导的信号之间的动态平衡所调节的。正常细胞表面通过表达 MHC - I 分子，引发 NK 细胞的抑制性信号传导，从而避免受到 NK 细胞的攻击。
然而，病毒感染的细胞或肿瘤细胞通常会下调 MHC - I 的表达，以此逃避依赖于检测 MHC - I 呈递的抗原肽的 CD8 + T 细胞的识别。相反，这种 MHC - I 抑制性受体配体的缺失和 / 或活化受体配体的上调，能够激活 NK 细胞，进而引发 NK 细胞的自发攻击。NK 细胞激活后，会通过释放大量的穿孔素和颗粒酶来诱导靶细胞凋亡。
NK 细胞杀伤肿瘤细胞主要通过以下四种方式来完成：
（一）直接杀伤
NK 细胞直接通过胞吐作用，释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒性颗粒。穿孔素在靶细胞表面穿孔，使颗粒酶进入靶细胞，从而诱导靶细胞凋亡。（二）诱导细胞凋亡
活化的 NK 细胞表达 Fas（CD95）配体和 TRAIL（肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体）分子，诱导 CD95 + 靶细胞和 TRAIL 受体阳性的靶细胞通过内源酶的级联反应发生凋亡，使靶细胞进入程序性凋亡状态。（三）细胞因子介导杀伤
NK 细胞能合成和分泌多种细胞因子（如 IFN - γ、TNF - α、IL1、IL5、IL8、IL10 和 G - CSF 等），这些细胞因子可直接作用于靶细胞，或者通过进一步激活其他种类的免疫细胞来攻击靶细胞。（四）抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）
NK 细胞低亲和力的 CD16 分子与靶细胞 IgG 抗体复合物结合后，活化蛋白酪氨酸激酶（PTK），使 PLCγ 的酪氨酸磷酸化，裂解膜磷酯酰肌醇为三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油。IP3 增加细胞内游离钙浓度，进而释放细胞毒性物质（如穿孔素和颗粒酶）。二、细胞因子激活 NK 细胞
细胞因子是维持多种免疫细胞激活和功能性的关键成分。通过多种激活性细胞因子或抑制性细胞因子的拮抗剂，能够刺激并增强患者 NK 细胞的抗肿瘤作用。
（一）IL - 2
IL - 2 可直接刺激 T 细胞和 NK 细胞的增殖和活化。最初发现用 IL - 2 刺激人外周血单核细胞会扩增细胞毒性细胞，命名为淋巴细胞活化杀伤细胞（LAK）。随后的研究发现，LAK 细胞对肿瘤的破坏主要由 NK 细胞介导。后续研究发现，IL - 2 可诱导抑制性调节性 T 细胞（Treg）的产生，这限制了 IL - 2 激活 NK 细胞的应用。（二）IL - 15
IL - 15 是 IL - 2 最有前途的替代品。重要的是，IL - 15 刺激 NK 和 CD8 + T 细胞，但不刺激 Treg 细胞。体外研究表明，IL - 15 可以增强被肿瘤微环境（TME）耗尽的 NK 细胞的功能。在缺氧条件下，用 IL - 15 治疗功能失调的肿瘤来源的 NK 细胞，可以恢复线粒体的完整性，增加颗粒酶 B 的表达，减少细胞凋亡，增强 NK 细胞毒性和 IFNγ 的产生。（三）IL - 12
IL - 12 主要由抗原呈递细胞，特别是 DC 和巨噬细胞产生，刺激 CD8 + T 细胞和 NK 细胞的募集、效应功能以及 IFNγ 的产生。除了直接激活 NK 细胞外，IL - 12 还刺激 Th1 产生 IFNγ 和 IL - 2，从而刺激 NK 细胞产生更多的 IFNγ、穿孔素和颗粒酶 B。IL - 12 全身给药会引起多种不良副作用，在最大耐受剂量下也只能发挥有限的抗癌功效。目前正在开发替代的 IL - 12 递送方法（如抗体融合的 IL - 12、IL - 12 的 DNA/RNA 的直接递送、瘤内注射外泌体表达的 IL - 12），以期改善 IL - 12 的疗效。
（四）IL - 18
IL - 18 是一种促炎细胞因子，由多种细胞产生，包括髓细胞、肠上皮细胞、角质形成细胞和内皮细胞。IL - 18（与 IL - 12 联合）能够诱导 NK 细胞表达 FASL、增强 NK 细胞产生 IFNγ 和 TNF 的能力、促进 NK 细胞增殖，并通过诱导 CCL21、CCR7 的表达促进 NK 向次级淋巴器官迁移。（五）IL - 21
IL - 21 由 Th17 细胞和 DC 细胞产生。IL - 21 通过刺激 NK 细胞增加穿孔素和颗粒酶 B 的表达，并上调 NKp30 和 NK 细胞受体 2B4 来增强 NK 细胞的成熟和增殖，并增强其细胞毒性活性。常与 IL - 2、IL - 15、IL - 18 等细胞因子联合使用。（六）TGF - β 抑制剂
TGFβ 能够抑制 NK 细胞功能，并促进其分化为 ILC1，成为毒性大大降低的组织驻留型细胞，对肿瘤的杀伤作用大幅度减弱。抑制肿瘤微环境中的 TGFβ 是恢复 NK 细胞功能的重要策略。针对 TGFβ 的药物大致有三类：中和抗体、配体陷阱、受体激酶抑制剂。三、免疫检查点抑制激活 NK 细胞活性
许多肿瘤的发展与 NK 细胞功能异常有关。因此，恢复 NK 细胞功能可能是抗肿瘤免疫治疗的潜在选择。在 T 细胞参与的抗肿瘤过程中，免疫检查点抑制已研究成功。NK 细胞同样也有相同的抗肿瘤机制。
在 NK 细胞背景下，尝试基于 T 细胞的免疫检查点抑制剂（例如 CTLA - 4 和 PD - 1 抑制剂）的组合，如抗 PD - 1 和抗 PD - L1 抑制剂也已显示出能增强 NK 细胞介导的细胞毒性。通过研发更新的免疫检查点（例如 B7 - H3、CD200R、CD47 和 Siglecs7/9），将这些检查点组合以产生协同的抗肿瘤反应似乎更加合乎逻辑。
除此之外，还有一些 NK 特有的免疫检查点：
（一）NKp44
NKp44 的胞质结构域包含一个免疫受体酪氨酸抑制（ITIM）基序。当表达 PCNA 的肿瘤细胞与 NK 细胞接触结合时，通过 NKp44 - PCNA 轴传导抑制信号。（二）KIR3DL3
KIR3DL3 可能受免疫抑制性 TME 诱导而表达上调，通过与配体 HHLA2 结合传导抑制信号。KIR 是第一个开发用于刺激 NK 细胞反应的 ICI 抗体。（三）NKG2A
NKG2A 主要存在于实体瘤浸润性 NK 细胞中，其配体 HLA - E 在多种肿瘤中表达被上调。四、增强 ADCC 作用的策略
NK 细胞可通过 CD16 受体介导的 ADCC，杀死 IgG1 或 IgG3 抗体靶向的细胞。NK 细胞表面 CD16 的不同形态，会影响 CD16 与抗体 Fc 端的亲和力。
具体来说，CD16 蛋白第 158 位的氨基酸为苯丙氨酸（158F）时，与 Fc 的亲和力低；而这一位置上的氨基酸为缬氨酸（158V）时，与 Fc 的亲和力高。新一代单克隆抗体疗法很多对 Fc 端进行了修饰，改善了它们与 CD16 的结合，促进了 ADCC 的产生。同时，很多抗体在合成时使用了预防抗体 Fc 端岩藻糖基化的哺乳动物培养系统，增强了它们与 CD16 的结合。
（一）双特异性抗体
双特异性抗体可同时与激活 NK 细胞的受体和肿瘤抗原相结合，促进更有效和持久的 NK 介导细胞毒性。与单抗不同，这些融合蛋白可以被设计成与多种不同的肿瘤抗原和 NK 受体相结合，并且可以利用抗体可变区片段（Fv）与 CD16 结合，保证它们可以与 158V C16 和 158F C16 有效结合。类似的蛋白设计已经在双特异性 T 细胞衔接器（BiTE）中得到应用。目前，Affimed 公司开发的 AFM13 是临床进展最快的 CD16 双特异性抗体之一。这是一款靶向 CD30 的双特异性抗体。在治疗霍奇金和非霍奇金淋巴瘤患者的 1 期临床试验中，它与脐带血来源的 NK 细胞联用，在治疗的 12 名患者中，达到 100% 的客观缓解率。
（二）三特异性抗体
三特异性 NK 细胞衔接器不但可与肿瘤抗原和 CD16 受体结合，还可包含 IL - 15，从而与 IL - 15 受体（位于 NK 细胞表面）相结合，增强 NK 细胞的活性。三特异性抗体，由于具有同时与不同 NK 细胞受体结合的潜力，因此正在成为 NK 细胞免疫疗法的一个令人兴奋的前沿。不过，哪些激活性受体组合能够最大程度增强 NK 细胞的抗癌活性仍然需要更多研究。五、过继性 NK 细胞疗法
NK 细胞是研究人员开发新型免疫疗法的理想之选。当前，正在研发的 NK 细胞治疗产品主要分为两类：一类是自体或异体 NK 细胞治疗产品，另一类则是 CAR - NK 产品。
在增强 NK 细胞功能方面，于体外培养过程中运用细胞因子进行刺激，常用的细胞因子为 IL - 2。近年来，IL - 12、IL - 15、IL - 18、IL - 21 等刺激因子也被用于体外刺激 NK 细胞，并且能够诱导出可长期生存且具有记忆能力的 NK 细胞。
CAR - NK 能够赋予 NK 细胞靶向特定肿瘤的能力。CAR - NK 细胞具有诸多优势，如细胞因子释放综合征风险更小、神经毒性更低。即便 CAR - NK 细胞失去了 CAR，仍可凭借内在表达的激活性受体识别并杀伤肿瘤细胞。
除了 CAR - NK 之外，研发人员还在探索其他增强 NK 细胞功能的基因工程策略，其中包括通过表达趋化因子受体来促进肿瘤浸润。基于 ADCC 的疗法能够在 NK 细胞上表达高亲和力的 138V CD16 受体，与激发 ADCC 的抗体联合使用，构成组合疗法。
最后，利用 CRISPR - Cas9 基因编辑系统可以从 NK 细胞中敲除副调控因子。这些手段为构建更优的 NK 细胞疗法提供了多种可能性。
六、文末小结
自然杀伤细胞（NK 细胞）具备独特的抗肿瘤效应，其不受 MHC 限制的细胞毒性、能够产生细胞因子以及具有免疫记忆等功能，使其成为先天性和适应性免疫反应系统中的关键角色。早期临床数据显示，NK 细胞非常适合用于异体治疗环境。
临床研究表明，NK 细胞在治疗血液系统恶性肿瘤方面具有安全性和有效性。重要的是，无论采用何种方法，NK 细胞疗法始终展现出良好的安全性。迄今为止，尚未观察到细胞因子释放综合征（CRS）或移植物抗宿主病（GVHD）。然而，大多数成功的报道仅限于血液系统恶性肿瘤，并非所有患者对 NK 细胞治疗都有反应，部分患者最终仍会复发。
CAR - NK 细胞疗法是一个极具前途的临床研究领域，对某些癌症患者具有良好的安全性和初步疗效。相信基于 NK 细胞的新型细胞疗法有望引发肿瘤免疫治疗的革命性进展。
参考资料：
[1] Laskowski, T.J., Biederstädt, A. & Rezvani, K. Natural killer cells in antitumour adoptive cell immunotherapy.Nat Rev Cancer (2022).
[2] Maskalenko et al., Harnessing natural killer cells for cancer immunotherapy: dispatching the first responders. Nature Reviews Drug Discovery, (2022).
[3] Le Saux and Schvartzman Advanced Materials and Devices for the Regulation and Study of NK Cells. Int. J. Mol. Sci., (2019).
[4] Zhang et al.,. CAR-NK cells for cancer immunotherapy: from bench to bedside. Biomarker Research,(2022)