关于 NK 细胞免疫治疗恶性肿瘤的研究新动态
【摘要】细胞免疫治疗作为针对自身免疫细胞能力低下的恶性肿瘤患者的新型补充疗法，涵盖基于 T 细胞的嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）疗法、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）疗法，基于 NK 细胞的嵌合抗原受体 NK 细胞（CAR-NK）疗法和自体细胞免疫疗法（CIK），以及基于其他免疫细胞（如单核吞噬细胞，包括树突状细胞和巨噬细胞）的输注治疗。其中，自然杀伤细胞（NK 细胞）作为机体天然免疫的重要细胞，在抗肿瘤、抗病毒感染及免疫调节方面发挥着关键作用。它既能像 T 细胞那样经工程化改造后靶向治疗肿瘤，又能进行同种异体来源的 NK 细胞输注治疗，弥补了 T 细胞自体来源受限和异体免疫排斥的不足。研究表明，输注异体 NK 细胞的患者不会发生严重的移植物抗宿主病（GVHD）。NK 细胞不仅拓展了用于细胞免疫治疗的细胞种类，还为形成低成本的细胞免疫治疗产品提供了广阔前景。然而，目前仍存在 NK 细胞质量不稳定、制备流程缺乏统一质量标准等问题，尽管部分 NK 细胞免疫治疗产品已获美国食品药品监督管理局（FDA）或国家药品监督管理局（NMPA）批准，但仍未有明确公开的 NK 细胞免疫治疗产品规范生产体系。本文从 NK 细胞独特的免疫调节作用机制出发，综合近年来研究者利用 NK 细胞在恶性肿瘤治疗中的治疗策略及临床前研究和临床试验的最新进展，最终聚焦于 NK 细胞的体外扩增方法及活性功能维持的研究进展，表明 NK 细胞有望形成质量统一的细胞免疫治疗产品。
肿瘤免疫治疗通过提升患者自身免疫系统能力来实现长期抗肿瘤效果，为传统抗肿瘤疗法疗效不佳的患者提供了新的治疗策略和有力辅助。当前已开展的细胞免疫治疗多集中于基因改造免疫细胞后用于靶向治疗恶性肿瘤。已有多种 CAR-T 获得 FDA 批准进入临床试验，但该疗法成本高昂，易引发细胞因子释放综合征和移植物抗宿主病，且免疫排斥强、细胞来源受限。而 NK 细胞作为固有免疫细胞，通过受体进行免疫调节，能直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞；NK 细胞杀伤肿瘤的机制对特异性抗体要求低，不会引起患者免疫排斥；NK 细胞异体回输的安全性已得到证实，其来源种类多，形成细胞产品的成本也较低。基于此，研究者对不同来源的 NK 细胞采用细胞因子诱导、联合单抗和工程化改造等方法激活 NK 细胞抗肿瘤活性，并将其用于临床前与肿瘤作用研究和临床试验研究。本文结合国内外近年报道，对 NK 细胞的杀瘤机制、活性调节策略、用于临床试验的进展以及 NK 细胞来源及扩增方法进行综述，以期为 NK 细胞在恶性肿瘤治疗中的应用以及 NK 细胞体外扩增体系的建立提供参考价值。
1.NK 细胞免疫特性和抗肿瘤机制
1.1 NK 细胞的生物学特性
NK 细胞起源于骨髓中的共同淋巴祖细胞（CLP），其发育主要依赖细胞因子和转录因子。人体外周血 NK 细胞以 CD56 为表型特征，根据 CD56 表达量分为 CD56dim 和 CD56bright 两个细胞亚群。前者占大多数，被视为成熟的 NK 细胞，可大量分泌高免疫活性细胞因子，同时表达 CD16，介导抗体依赖性的细胞毒作用（ADCC）。NK 细胞受刺激后，通过激活受体与配体之间的相互作用（NK 细胞受体 NKR 和靶细胞表面的配体如人白细胞抗原分子 HLA 结合），NK 细胞活化并释放细胞毒素，杀伤靶细胞。NKR 主要包括杀伤免疫球蛋白样受体（KIR）家族和杀伤凝集素样受体（NKG2）家族。KIR 是一类抗体样受体，通过与 HLA 类分子结合调节 NK 细胞的活化和抑制。KIR 家族成员的表达存在个体差异，其中抑制性受体与 HLA 类分子结合后，可抑制 NK 细胞活化。因此，人类白细胞抗原（HLA）低表达的肿瘤细胞对 NK 细胞的杀伤更敏感。NKG2 家族包括 NKG2A、NKG2C、NKG2D 等受体，可发挥抑制和活化 NK 细胞的作用。其中 NKG2D 表达最广泛，能与许多肿瘤细胞和感染细胞表面的配体结合，激活 NK 细胞。NK 细胞表面还表达一些细胞黏附分子，促进 NK 细胞与其他细胞（如 T 细胞、树突状细胞和巨噬细胞）的黏附和活化，共同构建人体的免疫防线。
1.2 NK 细胞和肿瘤的相互作用
NK 细胞通过多种机制参与抗肿瘤免疫反应：NK 细胞表面受体 CD16 通过 ADCC 效应杀伤肿瘤细胞；NK 细胞可释放穿孔素、颗粒酶激活凋亡系统攻击肿瘤细胞；NK 细胞能够表达死亡配体（FASL）结合靶细胞死亡受体（FAS）引起靶细胞凋亡。与激活过程需要进行抗原处理和呈递的 T 细胞不同，NK 细胞进行免疫应答无需肿瘤细胞预先致敏，也无需特异性抗体，直接由 NK 细胞的活化抑制受体与靶细胞的相互作用进行控制。NK 表面 KIR 亚群在结合特定 HLA 分子时，能够阻断 NK 细胞识别和攻击靶细胞的作用；而对不表达 KIR 可结合 HLA 分子的靶细胞，NK 细胞会被激活，发挥细胞毒性作用。NK 细胞还会在受体调节下分泌多种细胞毒素和细胞因子，直接杀伤肿瘤细胞并诱导免疫反应。为逃避 NK 细胞的识别和攻击，肿瘤细胞会下调 NK 细胞的激活受体，导致 NK 细胞功能失调，细胞毒性减弱。肿瘤细胞还能结合抑制性受体以及产生免疫抑制因子如 TGF-β、IL-10、PGE2 等，直接对 NK 细胞进行免疫抑制。研究表明 NK 细胞为抑制性受体 NKG2A 阳性的肿瘤患者预后较差。此外，肿瘤微环境（TME）中存在大量免疫抑制性细胞，如调节性 T 细胞（Tregs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）等，阻碍 NK 细胞进入肿瘤核心。肿瘤代谢物的积累也会抑制 NK 细胞的杀伤能力。目前对肿瘤免疫逃逸的研究聚焦于上调激活性受体或下调抑制性受体的表达水平以增强 NK 细胞的杀伤活性；通过细胞因子或其他诱导颗粒使 NK 细胞形成记忆，提高靶向治疗肿瘤的能力；探索肿瘤细胞的免疫逃逸机制，如神经胶质瘤等逃避 NK 细胞免疫和 NK 细胞对肿瘤细胞低反应性的关键靶点，为抗肿瘤疗法提供新思路。
2.NK 细胞临床应用进展
2.1 NK 细胞治疗策略的改进
2.1.1 NK 细胞活性调节策略
NK 细胞与靶细胞的相互作用由受体传递信号，产生级联反应调控。研究提示，阻断 KIR 受体的抑制性信号，利用免疫抑制检查点 SHP-1 的缺失，可降低免疫细胞激活的阈值，增强 NK 细胞毒性。一些免疫检查点抑制剂如抗 PD-1、抗 CTLA-4 抗体可修复 NK 细胞抗肿瘤效应，阻断抑制性受体的作用，逆转 NK 细胞在 TME 中的免疫耗竭状态，减少恶性肿瘤细胞逃逸。CD73 的含量与肿瘤代谢正相关，其过表达会导致细胞外腺苷失调，使肿瘤细胞发生免疫逃逸。因此，CD73 抑制剂联合抗 PD-1 可用于恶性肿瘤治疗。NK 细胞联合特异性针对肿瘤的抗体可增加 NK 细胞的靶向性，充分发挥 NK 细胞的毒性。减少 NK 细胞负调控抗体与 NK 细胞的结合也是改善 NK 细胞活力的新策略。研究发现，对多发性骨髓瘤有良好疗效的 CD38 单克隆抗体对抗肿瘤 NK 细胞有极大副作用，减少两者联合反而能更好治疗多发性骨髓瘤。T 细胞来源的 IL-22 可促进肿瘤细胞表达 CD155 从而抑制 NK 细胞功能，使肿瘤细胞发生肺转移。目前已有报道 IL-15 联合 TIGHT 基因可抑制黑色素瘤表达 CD155，减少 CD155 对 NK 细胞的活性抑制。NK 细胞能杀灭循环肿瘤细胞，为抗肿瘤疗法提供新途径。刺激 NK 细胞释放更多肿瘤坏死因子和促炎因子，可增强其对肿瘤细胞的毒性和趋化性。常见的 γ 链细胞因子（IL-2、IL-15、IL-7、IL-21）均能促进 NK 细胞的增殖和分泌能力。通过清除患者血浆中的人类癌细胞表面抗原 MICA 分子，IL-2 激活的人外周血 NK 细胞能够恢复 NKG2D 介导的对神经母细胞瘤的杀伤作用；IL-15 与 IL2 共享 NK 细胞表面的信号转导通道，均可激活和刺激 NK 细胞的生长和发育，促进 NK 细胞之间的信息传递和结合，当 NK 细胞持续接触，细胞增殖和抗肿瘤功能会协同增加。
2.1.2 CAR-NK 临床前研究及进展
NK 细胞参与抗肿瘤的治疗手段不仅限于免疫检查点抑制和多种特异性抗体联合。NK 细胞表面的共刺激分子也是治疗恶性肿瘤的有吸引力的靶点。基于小鼠淋巴瘤临床前模型，研究者发现将 CD19-CAR 抗原和脐带血 NK 细胞结合，同时使用表达编码 IL-15 和诱导 caspase 9 的基因对 NK 细胞进行基因修饰后，NK 细胞杀伤淋巴瘤细胞的靶向性和毒性大大提高。临床前研究报道，IL-15 联合诱导型蛋白开关 MyD88/CD40 能够增强 CAR-NK 细胞的抗肿瘤疗效；CD33-CAR-NK 和 CD123-CAR-NK 被用于靶向攻击急性髓系白血病细胞；DLL3-CAR-NK-92 被证实对小细胞肺癌有杀伤性。将 CAR-NK 与其他 CAR - 细胞组合使用可能获得惊人效果。在多种肿瘤模型中，NK 细胞的胞啃作用使靶细胞抗原转移到 CAR 上，导致 CARs 持续激活和对自我 NK 细胞的识别，降低了 CAR-NK 细胞对肿瘤细胞的反应性，引起肿瘤复发，而双 CAR 可有效防止胞啃作用介导的肿瘤复发。NK 细胞泛特异性杀伤肿瘤的独特性提示它适合成为合成免疫治疗的细胞基底，构建能减毒增效的合成免疫分子，实现对恶性肿瘤的精准识别。
2.2 NK 细胞的临床试验及研究进展
目前，研究者利用 NK 细胞针对性治疗多种实体肿瘤，如胃癌、结直肠癌、胰腺癌等，正在进行临床试验，虽研究结果尚不完全，但已初步显示 NK 细胞的输注治疗在部分患者中能诱导肿瘤的抑制或缩小。NK 细胞工程化改造后治疗肿瘤的临床试验正逐步立项，且在治疗血液恶性肿瘤上已展现明显疗效。NK 细胞与免疫检查点抑制剂（如 PD-1/PD-L1 抗体）联合使用在耐药性肿瘤中疗效显著。需要指出的是，NK 细胞治疗的疗效因多种因素而异，包括肿瘤类型、患者个体差异、细胞治疗产品质量等。目前的临床试验大部分仍处于早期阶段，需进一步临床研究和证据来评估其疗效。
2.2.1 NK 细胞过继免疫疗法
NK 细胞过继免疫疗法涵盖自体回输和异体回输两种方式，在血液系统肿瘤的治疗中已取得良好成效。当下，NK 细胞自体回输多应用于复发性实体瘤或易转移的晚期癌症治疗。在儿童脑室膜瘤及儿童复发性成神经管瘤的治疗中，研究者首次通过脑室向人体注射 NK 细胞，作为放疗的辅助手段，其输注疗效已得到证实。此外，NK 细胞自体回输治疗肝癌的临床试验正在招募受试者，已有研究表明该方法治疗晚期肝癌的疾病控制率可达 80%。对于易转移的鼻咽癌、非小细胞肺癌和乳腺癌，近两年 NK 细胞不再局限于单纯回输，而是更多地作为辅助疗法与其他药物联合用于患者治疗。美国 FDA 批准了一项阿扎胞苷、维奈托克和同种异体脐带血 NK 细胞（CB-NK）治疗急性髓系白血病的 IB 期试验。高危急性髓系白血病（AML）和骨髓异常增殖综合征（MDS）治疗失败的主要原因是骨髓移植后的复发，而异基因单倍体相同的供者记忆样 NK 细胞直接回输在一定程度上可防止复发。NK 细胞可能是异基因造血干细胞移植（HSCT）过程中移植物对抗白血病的主要因素。有研究指出，经符合药品生产质量规范（GMP）的细胞因子刺激后的外周血单个核细胞（PBMC）来源 NK 细胞对多发性骨髓瘤疗效显著。近几年，异体 NK 细胞过继疗法正逐渐从血液肿瘤疾病向实体瘤治疗过渡。使用 FDA 批准的体外 CB-NK 细胞联合西妥昔单抗免疫治疗患有微小残留病的结直肠癌患者已进入临床试验 IB 期，有望证实 NK 细胞异体输注的无毒性与有效性。不过，在晚期肾细胞癌和黑色素瘤患者的输注治疗过程中，虽未观察到严重不良事件，但抗肿瘤反应时效较短。对于复发难治性卵巢癌，采用异体 NK 细胞腹腔注射后，尚未观察到其在患者体内成功扩增。
2.2.2 CAR-NK 靶向治疗
被转导 CD19-CAR 的异体 NK 细胞在靶向治疗 B 细胞淋巴瘤的临床试验中取得了明确成果。国内国家药品监督管理局（NMPA）近年也批准了靶向 CD19 嵌合抗原受体基因修饰的 NK 细胞注射液进入临床试验，用于治疗复发和 / 或难治性大 B 细胞淋巴瘤。多项脐带血来源的异体 NK 细胞经 CD19-CAR 工程化改造后，用于治疗非霍奇金淋巴细胞瘤（NHL）的临床试验也在进行。CD70/CD5-CAR 工程化 IL-15 转导的脐带血 NK 细胞在美国 FDA 监管下治疗复发 / 难治性血液系统恶性肿瘤的 Ⅰ/Ⅱ 期研究已经立项。CAR-NK 在治疗实体瘤方面研究进展颇多，间皮素 - CAR-NK 注射液被国家药品监督管理局批准用于治疗晚期上皮性卵巢癌。高级别浆液性卵巢癌患者对常规治疗反应低下，以及一些具有耐药性的癌症如胰腺癌和间肾样腺癌，通过 FDA 批准的 TROP2-CARNK 进行腹膜注射治疗，均已进入临床试验研究。部分临床试验数据显示，CAR-NK 细胞治疗在部分患者和小鼠模型中能够产生持久的肿瘤消退和长期缓解的效果。
3 NK 细胞的来源、体外培养和扩增
3.1 NK 细胞的主要来源
临床前研究中，原代 NK 细胞的主要来源包括人外周血单个核细胞（PBMC）、脐带血单个核细胞、NK 细胞株系（如 NK92）以及多能干细胞（iPSC）。PBMC 来源的 NK 细胞（PB-NK）和脐带血来源的 NK 细胞（CBNK）比例较低，难以大量获取，需经白细胞富集后进一步进行体外分选与扩增。与 CBNK 相比，PB-NK 获取相对简捷、易得且成本低。尽管 PB-NK 纯化和利用周期较长，细胞活性维持不易，但经过优化的体外扩增体系仍具有形成细胞免疫治疗产品的潜力。NK92 是临床前 NK 细胞杀瘤机制研究和 NK 细胞临床试验研究中使用最多的细胞系，其细胞稳定性好，纯化程序简单，但成本高且致瘤性令人担忧。iPSC 技术的供体细胞来源广泛，为各类细胞疗法包括使用 NK 细胞的肿瘤免疫治疗提供了潜在的通用细胞来源。iPSC 来源的 NK 细胞质量均一，且易于修饰以靶向杀伤肿瘤细胞，但所需技术复杂且价格高昂。表 3 对多种来源的 NK 细胞分选扩增方法进行了比较。
NK 细胞过继免疫治疗或 CAR-NK 细胞治疗癌症通常有自体和异体两种形式，输注量一般根据体表面积（BSA）计算，并在衡量患者具体情况、疾病类型和严重程度等因素后进行个体化决定。目前的 NK 细胞临床试验正在探索不同癌症患者的适宜 NK 细胞输注剂量。NK 细胞自体回输的主要来源是患者的外周血单个核细胞，可最大程度避免免疫排斥反应。然而，由于患者免疫功能下降，NK 细胞在数量、活性及功能维持方面存在限制，而同种异体 NK 细胞能够克服这一问题，因此同种异体 NK 细胞的输注与改造后输注成为一大研究热点。
3.2 NK 细胞的体外培养与扩增
目前，关于获得大量高纯度和高细胞毒性 NK 细胞的研究正在进行中。IL-2、IL-15、IL-18、IL-12、IFN-γ、TNF-α 等对 NK 细胞的活化和分化具有正调节作用，在体外培养时加入这些细胞因子可显著提高 NK 细胞的杀伤活性。CD16 对 NK 细胞的毒性具有诱导作用，且能反复激活 NK 细胞的激活性受体 NKG2D。研究表明，CD16 靶向的单克隆抗体能够增强 NK 细胞的扩增及分泌能力。除了在 NK 细胞扩增过程中添加激活剂、部分增强毒性的细胞因子与抗体外，一些化学药物如将聚（磷腙）树枝状聚合物添加到来自健康志愿者或多发性骨髓瘤患者的外周血单核细胞培养条件中，也能够提高 NK 细胞毒性。此外，以辐照的肿瘤细胞、PB 单核细胞或 B 淋巴细胞系作为饲养细胞扩增人 NK 细胞，也能使细胞显著扩增，但饲养细胞可能会对 NK 细胞的功能产生负调节作用。另外，FDA 监管的 NK 细胞株系或脐带血一般可作为一些 NK 细胞临床用产品的来源。NK92 细胞系是 FDA 首个批准的 NK 细胞株，它可杀死虫草素致敏的癌细胞，而虫草素作为免疫调节剂也成为增强 NK 细胞毒性的一种研究思路。
NK 细胞体外扩增的不同体系对 NK 细胞疗效的影响研究也正在进行临床试验。研究表明，单抗刺激 NK 细胞扩增和饲养细胞刺激 NK 细胞扩增的两种体系在造血干细胞移植后白血病初发的疗效上没有明显差异，仍需更多探索。此外，有研究报道了快速 NK 细胞产品实现的可能，即通过供体单采直接分离 NK 细胞，冷冻保存后在床边解冻并输注到患者体内。目前 NK 细胞冷冻保存的条件仍在探索中，冷冻保存的 NK 细胞重新解冻后加入细胞因子进行刺激能够保证其部分毒性。在不同来源的 NK 细胞和不同的研究目的下，保存条件和储存时间都有不同的限制，应当分别评估不同用法 NK 细胞的最优保存路径及其保存时间和稳定性。通过优化冷冻条件，建立良好的细胞储备体系，为形成 NK 细胞货架式产品打好基础。
4 NK 细胞治疗肿瘤进行临床实践的展望
临床前研究和临床试验展示了 NK 细胞在癌症治疗中的广阔前景，其快速杀死肿瘤细胞的作用速度、强大的效力以及广泛的适用性为新型免疫治疗开辟了新领域。日益发展的基因转导技术及 CRISPR-Cas9 等基因修饰技术可用于优化 NK 细胞在体内诱导肿瘤消退的能力；同种异体 NK 细胞体外扩增方法的逐步优化提高了 NK 细胞的活性，多种靶向抗原结构联合 NK 细胞治疗肿瘤减少了肿瘤细胞的免疫逃逸；且随着 NK 细胞治疗肿瘤临床试验的进展，NK 细胞敏感肿瘤治疗谱正逐渐形成。NK 细胞体外制备工艺及其作为辅助治疗和组合治疗的重要成分等方面，是未来值得关注的热点。加强 NK 细胞来源筛选及保持细胞质量稳定的研究，将为制备简便、高效、安全、经济的 NK 细胞应用于临床细胞免疫治疗提供更为精准的实验依据。
肿瘤免疫治疗通过提升患者自身免疫系统能力来实现长期抗肿瘤效果，为传统抗肿瘤疗法疗效不佳的患者提供了新的治疗策略和有力辅助。当前已开展的细胞免疫治疗多集中于基因改造免疫细胞后用于靶向治疗恶性肿瘤。已有多种 CAR-T 获得 FDA 批准进入临床试验，但该疗法成本高昂，易引发细胞因子释放综合征和移植物抗宿主病，且免疫排斥强、细胞来源受限。而 NK 细胞作为固有免疫细胞，通过受体进行免疫调节，能直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞；NK 细胞杀伤肿瘤的机制对特异性抗体要求低，不会引起患者免疫排斥；NK 细胞异体回输的安全性已得到证实，其来源种类多，形成细胞产品的成本也较低。基于此，研究者对不同来源的 NK 细胞采用细胞因子诱导、联合单抗和工程化改造等方法激活 NK 细胞抗肿瘤活性，并将其用于临床前与肿瘤作用研究和临床试验研究。本文结合国内外近年报道，对 NK 细胞的杀瘤机制、活性调节策略、用于临床试验的进展以及 NK 细胞来源及扩增方法进行综述，以期为 NK 细胞在恶性肿瘤治疗中的应用以及 NK 细胞体外扩增体系的建立提供参考价值。
1.NK 细胞免疫特性和抗肿瘤机制
1.1 NK 细胞的生物学特性
NK 细胞起源于骨髓中的共同淋巴祖细胞（CLP），其发育主要依赖细胞因子和转录因子。人体外周血 NK 细胞以 CD56 为表型特征，根据 CD56 表达量分为 CD56dim 和 CD56bright 两个细胞亚群。前者占大多数，被视为成熟的 NK 细胞，可大量分泌高免疫活性细胞因子，同时表达 CD16，介导抗体依赖性的细胞毒作用（ADCC）。NK 细胞受刺激后，通过激活受体与配体之间的相互作用（NK 细胞受体 NKR 和靶细胞表面的配体如人白细胞抗原分子 HLA 结合），NK 细胞活化并释放细胞毒素，杀伤靶细胞。NKR 主要包括杀伤免疫球蛋白样受体（KIR）家族和杀伤凝集素样受体（NKG2）家族。KIR 是一类抗体样受体，通过与 HLA 类分子结合调节 NK 细胞的活化和抑制。KIR 家族成员的表达存在个体差异，其中抑制性受体与 HLA 类分子结合后，可抑制 NK 细胞活化。因此，人类白细胞抗原（HLA）低表达的肿瘤细胞对 NK 细胞的杀伤更敏感。NKG2 家族包括 NKG2A、NKG2C、NKG2D 等受体，可发挥抑制和活化 NK 细胞的作用。其中 NKG2D 表达最广泛，能与许多肿瘤细胞和感染细胞表面的配体结合，激活 NK 细胞。NK 细胞表面还表达一些细胞黏附分子，促进 NK 细胞与其他细胞（如 T 细胞、树突状细胞和巨噬细胞）的黏附和活化，共同构建人体的免疫防线。
1.2 NK 细胞和肿瘤的相互作用
NK 细胞通过多种机制参与抗肿瘤免疫反应：NK 细胞表面受体 CD16 通过 ADCC 效应杀伤肿瘤细胞；NK 细胞可释放穿孔素、颗粒酶激活凋亡系统攻击肿瘤细胞；NK 细胞能够表达死亡配体（FASL）结合靶细胞死亡受体（FAS）引起靶细胞凋亡。与激活过程需要进行抗原处理和呈递的 T 细胞不同，NK 细胞进行免疫应答无需肿瘤细胞预先致敏，也无需特异性抗体，直接由 NK 细胞的活化抑制受体与靶细胞的相互作用进行控制。NK 表面 KIR 亚群在结合特定 HLA 分子时，能够阻断 NK 细胞识别和攻击靶细胞的作用；而对不表达 KIR 可结合 HLA 分子的靶细胞，NK 细胞会被激活，发挥细胞毒性作用。NK 细胞还会在受体调节下分泌多种细胞毒素和细胞因子，直接杀伤肿瘤细胞并诱导免疫反应。为逃避 NK 细胞的识别和攻击，肿瘤细胞会下调 NK 细胞的激活受体，导致 NK 细胞功能失调，细胞毒性减弱。肿瘤细胞还能结合抑制性受体以及产生免疫抑制因子如 TGF-β、IL-10、PGE2 等，直接对 NK 细胞进行免疫抑制。研究表明 NK 细胞为抑制性受体 NKG2A 阳性的肿瘤患者预后较差。此外，肿瘤微环境（TME）中存在大量免疫抑制性细胞，如调节性 T 细胞（Tregs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）等，阻碍 NK 细胞进入肿瘤核心。肿瘤代谢物的积累也会抑制 NK 细胞的杀伤能力。目前对肿瘤免疫逃逸的研究聚焦于上调激活性受体或下调抑制性受体的表达水平以增强 NK 细胞的杀伤活性；通过细胞因子或其他诱导颗粒使 NK 细胞形成记忆，提高靶向治疗肿瘤的能力；探索肿瘤细胞的免疫逃逸机制，如神经胶质瘤等逃避 NK 细胞免疫和 NK 细胞对肿瘤细胞低反应性的关键靶点，为抗肿瘤疗法提供新思路。
2.NK 细胞临床应用进展
2.1 NK 细胞治疗策略的改进
2.1.1 NK 细胞活性调节策略
NK 细胞与靶细胞的相互作用由受体传递信号，产生级联反应调控。研究提示，阻断 KIR 受体的抑制性信号，利用免疫抑制检查点 SHP-1 的缺失，可降低免疫细胞激活的阈值，增强 NK 细胞毒性。一些免疫检查点抑制剂如抗 PD-1、抗 CTLA-4 抗体可修复 NK 细胞抗肿瘤效应，阻断抑制性受体的作用，逆转 NK 细胞在 TME 中的免疫耗竭状态，减少恶性肿瘤细胞逃逸。CD73 的含量与肿瘤代谢正相关，其过表达会导致细胞外腺苷失调，使肿瘤细胞发生免疫逃逸。因此，CD73 抑制剂联合抗 PD-1 可用于恶性肿瘤治疗。NK 细胞联合特异性针对肿瘤的抗体可增加 NK 细胞的靶向性，充分发挥 NK 细胞的毒性。减少 NK 细胞负调控抗体与 NK 细胞的结合也是改善 NK 细胞活力的新策略。研究发现，对多发性骨髓瘤有良好疗效的 CD38 单克隆抗体对抗肿瘤 NK 细胞有极大副作用，减少两者联合反而能更好治疗多发性骨髓瘤。T 细胞来源的 IL-22 可促进肿瘤细胞表达 CD155 从而抑制 NK 细胞功能，使肿瘤细胞发生肺转移。目前已有报道 IL-15 联合 TIGHT 基因可抑制黑色素瘤表达 CD155，减少 CD155 对 NK 细胞的活性抑制。NK 细胞能杀灭循环肿瘤细胞，为抗肿瘤疗法提供新途径。刺激 NK 细胞释放更多肿瘤坏死因子和促炎因子，可增强其对肿瘤细胞的毒性和趋化性。常见的 γ 链细胞因子（IL-2、IL-15、IL-7、IL-21）均能促进 NK 细胞的增殖和分泌能力。通过清除患者血浆中的人类癌细胞表面抗原 MICA 分子，IL-2 激活的人外周血 NK 细胞能够恢复 NKG2D 介导的对神经母细胞瘤的杀伤作用；IL-15 与 IL2 共享 NK 细胞表面的信号转导通道，均可激活和刺激 NK 细胞的生长和发育，促进 NK 细胞之间的信息传递和结合，当 NK 细胞持续接触，细胞增殖和抗肿瘤功能会协同增加。
2.1.2 CAR-NK 临床前研究及进展
NK 细胞参与抗肿瘤的治疗手段不仅限于免疫检查点抑制和多种特异性抗体联合。NK 细胞表面的共刺激分子也是治疗恶性肿瘤的有吸引力的靶点。基于小鼠淋巴瘤临床前模型，研究者发现将 CD19-CAR 抗原和脐带血 NK 细胞结合，同时使用表达编码 IL-15 和诱导 caspase 9 的基因对 NK 细胞进行基因修饰后，NK 细胞杀伤淋巴瘤细胞的靶向性和毒性大大提高。临床前研究报道，IL-15 联合诱导型蛋白开关 MyD88/CD40 能够增强 CAR-NK 细胞的抗肿瘤疗效；CD33-CAR-NK 和 CD123-CAR-NK 被用于靶向攻击急性髓系白血病细胞；DLL3-CAR-NK-92 被证实对小细胞肺癌有杀伤性。将 CAR-NK 与其他 CAR - 细胞组合使用可能获得惊人效果。在多种肿瘤模型中，NK 细胞的胞啃作用使靶细胞抗原转移到 CAR 上，导致 CARs 持续激活和对自我 NK 细胞的识别，降低了 CAR-NK 细胞对肿瘤细胞的反应性，引起肿瘤复发，而双 CAR 可有效防止胞啃作用介导的肿瘤复发。NK 细胞泛特异性杀伤肿瘤的独特性提示它适合成为合成免疫治疗的细胞基底，构建能减毒增效的合成免疫分子，实现对恶性肿瘤的精准识别。
2.2 NK 细胞的临床试验及研究进展
目前，研究者利用 NK 细胞针对性治疗多种实体肿瘤，如胃癌、结直肠癌、胰腺癌等，正在进行临床试验，虽研究结果尚不完全，但已初步显示 NK 细胞的输注治疗在部分患者中能诱导肿瘤的抑制或缩小。NK 细胞工程化改造后治疗肿瘤的临床试验正逐步立项，且在治疗血液恶性肿瘤上已展现明显疗效。NK 细胞与免疫检查点抑制剂（如 PD-1/PD-L1 抗体）联合使用在耐药性肿瘤中疗效显著。需要指出的是，NK 细胞治疗的疗效因多种因素而异，包括肿瘤类型、患者个体差异、细胞治疗产品质量等。目前的临床试验大部分仍处于早期阶段，需进一步临床研究和证据来评估其疗效。
2.2.1 NK 细胞过继免疫疗法
NK 细胞过继免疫疗法涵盖自体回输和异体回输两种方式，在血液系统肿瘤的治疗中已取得良好成效。当下，NK 细胞自体回输多应用于复发性实体瘤或易转移的晚期癌症治疗。在儿童脑室膜瘤及儿童复发性成神经管瘤的治疗中，研究者首次通过脑室向人体注射 NK 细胞，作为放疗的辅助手段，其输注疗效已得到证实。此外，NK 细胞自体回输治疗肝癌的临床试验正在招募受试者，已有研究表明该方法治疗晚期肝癌的疾病控制率可达 80%。对于易转移的鼻咽癌、非小细胞肺癌和乳腺癌，近两年 NK 细胞不再局限于单纯回输，而是更多地作为辅助疗法与其他药物联合用于患者治疗。美国 FDA 批准了一项阿扎胞苷、维奈托克和同种异体脐带血 NK 细胞（CB-NK）治疗急性髓系白血病的 IB 期试验。高危急性髓系白血病（AML）和骨髓异常增殖综合征（MDS）治疗失败的主要原因是骨髓移植后的复发，而异基因单倍体相同的供者记忆样 NK 细胞直接回输在一定程度上可防止复发。NK 细胞可能是异基因造血干细胞移植（HSCT）过程中移植物对抗白血病的主要因素。有研究指出，经符合药品生产质量规范（GMP）的细胞因子刺激后的外周血单个核细胞（PBMC）来源 NK 细胞对多发性骨髓瘤疗效显著。近几年，异体 NK 细胞过继疗法正逐渐从血液肿瘤疾病向实体瘤治疗过渡。使用 FDA 批准的体外 CB-NK 细胞联合西妥昔单抗免疫治疗患有微小残留病的结直肠癌患者已进入临床试验 IB 期，有望证实 NK 细胞异体输注的无毒性与有效性。不过，在晚期肾细胞癌和黑色素瘤患者的输注治疗过程中，虽未观察到严重不良事件，但抗肿瘤反应时效较短。对于复发难治性卵巢癌，采用异体 NK 细胞腹腔注射后，尚未观察到其在患者体内成功扩增。
2.2.2 CAR-NK 靶向治疗
被转导 CD19-CAR 的异体 NK 细胞在靶向治疗 B 细胞淋巴瘤的临床试验中取得了明确成果。国内国家药品监督管理局（NMPA）近年也批准了靶向 CD19 嵌合抗原受体基因修饰的 NK 细胞注射液进入临床试验，用于治疗复发和 / 或难治性大 B 细胞淋巴瘤。多项脐带血来源的异体 NK 细胞经 CD19-CAR 工程化改造后，用于治疗非霍奇金淋巴细胞瘤（NHL）的临床试验也在进行。CD70/CD5-CAR 工程化 IL-15 转导的脐带血 NK 细胞在美国 FDA 监管下治疗复发 / 难治性血液系统恶性肿瘤的 Ⅰ/Ⅱ 期研究已经立项。CAR-NK 在治疗实体瘤方面研究进展颇多，间皮素 - CAR-NK 注射液被国家药品监督管理局批准用于治疗晚期上皮性卵巢癌。高级别浆液性卵巢癌患者对常规治疗反应低下，以及一些具有耐药性的癌症如胰腺癌和间肾样腺癌，通过 FDA 批准的 TROP2-CARNK 进行腹膜注射治疗，均已进入临床试验研究。部分临床试验数据显示，CAR-NK 细胞治疗在部分患者和小鼠模型中能够产生持久的肿瘤消退和长期缓解的效果。
3 NK 细胞的来源、体外培养和扩增
3.1 NK 细胞的主要来源
临床前研究中，原代 NK 细胞的主要来源包括人外周血单个核细胞（PBMC）、脐带血单个核细胞、NK 细胞株系（如 NK92）以及多能干细胞（iPSC）。PBMC 来源的 NK 细胞（PB-NK）和脐带血来源的 NK 细胞（CBNK）比例较低，难以大量获取，需经白细胞富集后进一步进行体外分选与扩增。与 CBNK 相比，PB-NK 获取相对简捷、易得且成本低。尽管 PB-NK 纯化和利用周期较长，细胞活性维持不易，但经过优化的体外扩增体系仍具有形成细胞免疫治疗产品的潜力。NK92 是临床前 NK 细胞杀瘤机制研究和 NK 细胞临床试验研究中使用最多的细胞系，其细胞稳定性好，纯化程序简单，但成本高且致瘤性令人担忧。iPSC 技术的供体细胞来源广泛，为各类细胞疗法包括使用 NK 细胞的肿瘤免疫治疗提供了潜在的通用细胞来源。iPSC 来源的 NK 细胞质量均一，且易于修饰以靶向杀伤肿瘤细胞，但所需技术复杂且价格高昂。表 3 对多种来源的 NK 细胞分选扩增方法进行了比较。
NK 细胞过继免疫治疗或 CAR-NK 细胞治疗癌症通常有自体和异体两种形式，输注量一般根据体表面积（BSA）计算，并在衡量患者具体情况、疾病类型和严重程度等因素后进行个体化决定。目前的 NK 细胞临床试验正在探索不同癌症患者的适宜 NK 细胞输注剂量。NK 细胞自体回输的主要来源是患者的外周血单个核细胞，可最大程度避免免疫排斥反应。然而，由于患者免疫功能下降，NK 细胞在数量、活性及功能维持方面存在限制，而同种异体 NK 细胞能够克服这一问题，因此同种异体 NK 细胞的输注与改造后输注成为一大研究热点。
3.2 NK 细胞的体外培养与扩增
目前，关于获得大量高纯度和高细胞毒性 NK 细胞的研究正在进行中。IL-2、IL-15、IL-18、IL-12、IFN-γ、TNF-α 等对 NK 细胞的活化和分化具有正调节作用，在体外培养时加入这些细胞因子可显著提高 NK 细胞的杀伤活性。CD16 对 NK 细胞的毒性具有诱导作用，且能反复激活 NK 细胞的激活性受体 NKG2D。研究表明，CD16 靶向的单克隆抗体能够增强 NK 细胞的扩增及分泌能力。除了在 NK 细胞扩增过程中添加激活剂、部分增强毒性的细胞因子与抗体外，一些化学药物如将聚（磷腙）树枝状聚合物添加到来自健康志愿者或多发性骨髓瘤患者的外周血单核细胞培养条件中，也能够提高 NK 细胞毒性。此外，以辐照的肿瘤细胞、PB 单核细胞或 B 淋巴细胞系作为饲养细胞扩增人 NK 细胞，也能使细胞显著扩增，但饲养细胞可能会对 NK 细胞的功能产生负调节作用。另外，FDA 监管的 NK 细胞株系或脐带血一般可作为一些 NK 细胞临床用产品的来源。NK92 细胞系是 FDA 首个批准的 NK 细胞株，它可杀死虫草素致敏的癌细胞，而虫草素作为免疫调节剂也成为增强 NK 细胞毒性的一种研究思路。
NK 细胞体外扩增的不同体系对 NK 细胞疗效的影响研究也正在进行临床试验。研究表明，单抗刺激 NK 细胞扩增和饲养细胞刺激 NK 细胞扩增的两种体系在造血干细胞移植后白血病初发的疗效上没有明显差异，仍需更多探索。此外，有研究报道了快速 NK 细胞产品实现的可能，即通过供体单采直接分离 NK 细胞，冷冻保存后在床边解冻并输注到患者体内。目前 NK 细胞冷冻保存的条件仍在探索中，冷冻保存的 NK 细胞重新解冻后加入细胞因子进行刺激能够保证其部分毒性。在不同来源的 NK 细胞和不同的研究目的下，保存条件和储存时间都有不同的限制，应当分别评估不同用法 NK 细胞的最优保存路径及其保存时间和稳定性。通过优化冷冻条件，建立良好的细胞储备体系，为形成 NK 细胞货架式产品打好基础。
4 NK 细胞治疗肿瘤进行临床实践的展望
临床前研究和临床试验展示了 NK 细胞在癌症治疗中的广阔前景，其快速杀死肿瘤细胞的作用速度、强大的效力以及广泛的适用性为新型免疫治疗开辟了新领域。日益发展的基因转导技术及 CRISPR-Cas9 等基因修饰技术可用于优化 NK 细胞在体内诱导肿瘤消退的能力；同种异体 NK 细胞体外扩增方法的逐步优化提高了 NK 细胞的活性，多种靶向抗原结构联合 NK 细胞治疗肿瘤减少了肿瘤细胞的免疫逃逸；且随着 NK 细胞治疗肿瘤临床试验的进展，NK 细胞敏感肿瘤治疗谱正逐渐形成。NK 细胞体外制备工艺及其作为辅助治疗和组合治疗的重要成分等方面，是未来值得关注的热点。加强 NK 细胞来源筛选及保持细胞质量稳定的研究，将为制备简便、高效、安全、经济的 NK 细胞应用于临床细胞免疫治疗提供更为精准的实验依据。